På klubplan har han været tilknyttet de hollandske hold FC Den Bosch (1993-1997), SC Heerenveen (1997-1998) og PSV Eindhoven (1998-2001) og har spillet for Manchester United 2001-2006. I perioden 2006-2010 spillede van Nistelrooy i den spanske topklub Real Madrid, mens han fra januar 2010 til juli 2011 repræsenterede den tyske storklub, Hamburger SV i en enkelt sæson.
I juni, 2011, blev det annonceret, at van Nistelrooy skifter til spanske Málaga CF i juli 2011.[1] Ruud van Nistelrooy offentligjorde den 14. maj 2012, at hans karriere som fodboldspiller var overstået og at han ikke længere er at finde på banen mere.